• 5

II. Липополисахариды (ЛПС)

Уже в ранних работах предполагалось, что ЛПС могут играть важную роль во взаимодействии бактерий Rhizobiaceae с растениями. На это указывала функциональная важность ЛПС энтеробак- терий в инфицировании клеток животных, а также в инфицировании бактерий фагами. Кроме того, ЛПС составляли один из основных компонентов наружной мембраны и уже поэтому были наиболее важными кандидатами на ведущую роль в межклеточных взаимодействиях. Было показа­но, что ЛПС Agrobacterium участвует в прикреплении этих патогенов к клеткам хозяев (Whatley et al, 1970, 1977). Имелись и факты в пользу того, что прикрепление клеток Rhizobium к корням бобовых растений-хозяев определяется взаимодействием растительных лектинов и ризобиальных ЛПС (Wolpert et al, 1976; Kato et al, 1979, 1980, 1981). Прикрепление ризобий и агробактерий к растительным клеткам будет обсуждаться в главе 11. Последующие работы о бобово-ризобиальных взаимодействиях (см. ниже) показали, что ЛПС участвуют и в более поздних стадиях инфекции.

Хотя ЛПС и играют важную роль в симбиотическом взаимодействии (Noel et al, 1986; Carlson et al, 1987a; Cava et al, 1989; de Maagd et al, 1989; Priefer, 1989; Stacey et al, 1991; Perotto et al, 1994), их конкретная функция остается неизвестной. Некоторые симбиотически дефектные му­танты полностью лишены О-цепи полисахарида. Полная утрата этой части ЛПС приводит к силь­ному изменению бактериальной поверхности. Поэтому остается неясным, является ли нарушение симбиотических свойств прямым или непрямым результатом данного изменения. Однако последу­ющие работы, проведенные с помощью моноклональных антител на ЛПС бактерий и бактерои­дов, показали, что изменения структуры ЛПС происходят в процессе развития симбиоза и эти изменения, по-видимому, связаны с О-цепью полисахаридной части ЛПС (Wood et al, 1989; Sindhu et al, 1990; Tao et al, 1992; Noel, 1992; Noel et al, 1996b; Kannenberg et al, 1992, 1994a, 1994b). Это показывает, что О-цепь ЛПС может непосредственно участвовать в микробно-расти- тельном взаимодействии.

Изменения структуры ЛПС и возможные функции ЛПС в симбиозе обсуждаются в секции II.F. В ближайших разделах мы обсудим очистку, структуру и некоторые аспекты биосинтеза ЛПС у Rhizobiaceae.

II.A. ВЫДЕЛЕНИЕ ЛПС

II.A.1. Процедуры экстракции

ЛПС Rhizobiaceae, как и ЛПС энтеробактерий, являются сложными соединениями, и еди­ничный препарат ЛПС содержит смесь молекул. Эта смесь обычно содержит молекулы, варьирую­щие по длине О-цепи полисахарида, корового олигосахарида и липида А, а также молекулы, лишенные О-цепи (рис. 1). Те из них, которые имеют О-цепь, обычно называют "гладкими" (smooth) или ЛПС-1, а лишенные О-цепи - "шероховатыми" (rough) или ЛПС-2. Иногда (напри­мер, у некоторых мутантов) выявляют укороченные варианты О-цепи (Carlson et al, 1995), их называют промежуточными или ЛПС-3, ЛПС-4, 5 и т.д. в зависимости от длины О-цепи.

Грубые препараты ЛПС ризобий и агробактерий могут быть получены различными общими методами, разработанными первоначально для очистки ЛПС энтеробактерий. Они включают экст­ракцию трихлоруксусной кислотой, смесью петролейный эфир/хлороформ/фенол (Galanos et al, 1969) и горячую водно-фенольную методику (Westphal et al, 1965). В настоящее время почти все ЛПС ризобий экстрагируют с использованием последней методики. При повышенной температуре для экстракции используется гомогенная фаза воды и фенола, которая разделяется на две фазы

после охлаждения. Более гидрофобные компоненты оказываются в фенольной фазе, а более гид­рофильные — в водной.

Водно-фенольная экстракция штаммов R. leguminosarum и R. etli обеспечила получение ЛПС как в фенольном, так и в водном слоях. ЛПС из фенольного слоя содержал большее количество длинных цепей жирных кислот, чем ЛПС из водного слоя. Экстракция некоторых ЛПС мутантов, имеющих редуцированную О-цепь, обеспечила выделение ЛПС из обоих слоев, однако в феноль­ном слое содержалась большая его часть, чем у исходного штамма. ЛПС из S. meliloti, S. fredii и А. tumefaciens также выявляли в обоих слоях, но в основном в водном слое (Carlson et al, 1985; Russa et al, 1991, 1996; Weibgen et al, 1993; Reuhs et al, 1993, 1994a).

ЛПС из В. japoniucm и В. elkanii отличался от ЛПС Rhizobium тем, что после водно-фенольной экстракции большая его часть находилась в фенольном слое (Carrion et al, 1990). За исключением штамма USDA110 В. japoniucm, для представителей всех серогрупп данных бактерий ЛПС обнару­живается исключительно в фенольном слое. Анализ одного из этих ЛПС показал, что его О-цепь сильно О-ацетилирована, причем как О-цепь, так и коровый олигосахарид был лишен заряжен­ных гликозильных остатков, за исключением Kdo (Carrion et al, 1990; Carlson et al, 1992). Поэто­му очевидно, что ЛПС В. japonicum является сильно гидрофобным, что и обеспечивает его полный переход в фенольную фракцию.

Хотя горячая водно-фенольная методика широко используется для получения грубых препа­ратов ЛПС, она имеет ряд недостатков. Поскольку обычно изучается водная фаза, некоторые формы ЛПС могут быть утрачены. Для В. japonicum и В. elkanii ЛПС экстрагируются исключительно в фенольную фазу, что осложняет их последующую очистку. Для некоторых мутантов, имеющих редуцированную О-цепь, водно-фенольная экстракция оказалась малоэффективной. В то же вре­мя, для структурных и биологических исследований часто оказывается важным получить большие количества ЛПС. Водно-фенольная экстракция 100-400 л бактериальной культуры может оказать­ся очень сложной и даже опасной из-за большого количества необходимого фенола.

Поэтому в последние годы были предложены новые методики экстракции. Большие количе­ства всех форм ЛПС ризобий и агробактерий могут быть экстрагированы путем простого перемеши­вания клеточного осадка в растворе EDTA-триэтанол-амина (TEAoL) (рН=7) или EDTA-триэтила- мина (TEA) (рН=7) в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Экстракция с помощью EDTA-TEA улучшается при добавлении 5% фенола и повышении температуры до 60' С. Эта быст­рая и простая процедура позволяет обрабатывать большие количества бактерий, но может исполь­зоваться и малом масштабе для выявления минорных различий в структуре ЛПС (Valverde et al, 1997).

II.A.2. Очистка ЛПС

После того, как путем экстракции получен грубый препарат ЛПС, он подлежит дальнейшей очистке. Для этого используют различные методы, выбор которых зависит от вида бактерий.

Гель-фильтрационная хроматография с использованием сефарозы 4В в буфере EDTA-TEA используется для очистки ряда ризобиальных ЛПС, например ЛПС R. leguminosarum (Carrion et al, 1990; Carlson et al, 1992). Этот метод позволяет отделить ЛПС от примеси внеклеточного ЭПС и от низкомолекулярных углеводов, например, от циклических р-2-связанных глюканов.

Фильтрация в геле сефарозы 4В была использована также для очистки ЛПС S. meliloti и S. fredii. Однако грубые препараты ЛПС были загрязнены большим количеством Kdo-богатых К-антиге­нов, которые не удалось полностью отделить с помощью данной процедуры (Reuhs et al, 1993). Одним из методов, позволяющих надежно отделить ЛПС от К-антигенов, является гель-фильтраци­онная хроматография на сефадексе G-150 в присутствии буфера, содержащего 1% дезоксихолат (DOC) (Reuhs et al, 1993). Это обеспечивает де-агрегацию ЛПС и, следовательно, позволяет отделить отно­сительно более крупный К-антиген. Интересно, что эта процедура позволяет разделять ЛПС различ­ной молекулярной массы, например, отделять ЛПС-1 от ЛПС-2 (Reuhs et al, 1994а).

Препаративный гель-электорофорез — другой метод очистки ЛПС (Kim et al, 1996b). Он позволяет: а) отделить ЛПС от К-антигена или других типов КПС у различных бактерий; б) отде­лить КПС от липид-связанных КПС; в) разделять дискретные по размеру классы КПС, К-антиге-

нов и ЛПС. С его помощью могут быть выделены и дискретные классы ЭПС. Для препаративного гель-электрофореза может быть достаточным всего 100 мг грубого экстракта ЛПС. Первоначально образец подвергается электрофорезу в отсутствие DOC. При этом ЛПС остается крупномолекуляр­ным агрегатом и не входит в разделяющий гель. Однако, кислый К-антиген или КПС мигрируют сквозь гель и элюируют из него. После элюции К-антигена в буфер электрофореза добавляют DOC. Он де-агрегирует ЛПС, который затем мигрирует сквозь гель и разделяется на фракции с различ­ным размером.

Наиболее удобным и эффективным методом получения высокоочищенных ЛПС Rhizobium яв­ляется афинная хроматография на колонках, содержащих полимиксин-агарозу. Полимиксин пред­ставляет собой ацилированный циклический пептидный антибиотик, который активно связывается с липидом А из ЛПС (Morrison et al., 1976; David et al, 1992). Грубые экстракты, полученные при любой из описанных выше процедур, могут быть нанесены на такую колонку. После нанесения образца колонка с полимиксином последовательно элюируется растворами с возрастающей ионной и хаотропической силой для того, чтобы элюировать компоненты, не являющиеся ЛПС и связанные неспецифическими слабыми взаимодействиями. Когда все посторонние компоненты элюируют из колонки, ее промывают 1% DOC или сильным хаотропным раствором (например, 4 М гуанидином) для того, чтобы смыть ЛПС. Электрофорез элюированных ЛПС в полиакриламидном геле в присут­ствие DOC показывает полное отсутствие компонентов, не являющихся ЛПС.

Очищенный ЛПС, получаемый в результате полимиксин-афинной хроматографии, часто более чист, чем ЛПС, получаемый стандартными методами гель-фильтрации. Все изученные ЛПС Rhizobiaceae (R. etli, R. leguminosarum, S. meliloti, S. fredii, Rhizobium sp, Agrobacterium) связываются с полимиксин-агарозой. Эти полимиксин-очищенные препараты состоят из смеси различных по размеру ЛПС, имеющихся у бактерии. Смешанный ЛПС может быть очищен с использованием одной из описанных методик.

Сочетание упрощенной процедуры экстракции с использованием EDTA-TEAoL или EDTA- TEA и полимиксин-афинной хроматографии позволяет очистить ЛПС в две стадии. При этом могут быть использованы как большие, так и малые количества ЛПС (Valverde et al, 1997).

II.В. СТРУКТУРА ЛПС

Определение структуры ЛПС Rhizobiaceae в целом производится с помощью тех же методов, которые используют для энтеробактерий и при изучении разных гликоконъюгатов. Структурная характеристика включает определение: а) состава гликозилов и жирных кислот, б) гликозильных связей, в) аномерных и стереохимических конфигураций гликозила, г) последовательности гли­козильных остатков и локализацию жирнокислотных замещающих групп. Этот анализ требует ис­пользования комбинированной газо-жидкостной хроматографии (GLC) и масс-спектрометрии (MS), спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (NMR) и методик MS, таких как бомбардировка быстрыми атомами (FAB-MS), электроскопия-ионизация (ESI-MS) и лазерное определение вре­мени полета с помощью матриц (MALDITOF-MS).

Благодаря сложности и структурной гетерогенности ЛПС, изучение их структуры сталкива­ется с рядом проблем. Наиболее сложен анализ ЛПС Rhizobium, в которых отсутствуют некоторые компоненты, характерные для ЛПС энтеробактерий и которые содержит много редко встречаю­щихся или лабильных Сахаров в нестандартных позициях. Тем не менее, ЛПС всех проанализиро­ванных видов Rhizobiaceae имеют общие структурные мотивы с ЛПС энтеробактерий: структурное и функциональное разделение на три региона: полисахаридная О-цепь, олигосахаридный коровый район и липид-А (рис. 1),

II. В. 1. ЛПС Rhizobium leguminosarum и R. etli

Наиболее подробно изучены ЛПС R. leguminosarum и R. etli. О-цепи R. leguminosarum сильно различаются у разных штаммов и состоят из дезокси- и метилированных дезоксигликозильных остатков, а также из остатков уроновых кислот и иногда из остатков гептозила (Carlson et al, 1978; 1987а, 1987b; Carlson, 1984; Wang et al, 1994). Эти О-цепи состоят из повторяющегося

12 3

LPS I

 

LPS III, IV- LPS II -

 

Рисунок 2. Анализ липополисахаридов путем электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE). I — Rhizobium leguminosarum bv. viceae, штамм J28C53; 2 — R. etli, штамм CE3, 3 — R. leguminosarum bv. trifolii, штамм ANU843 (структуры разных форм ЛПС приведены на рисунке I).

олигомеризованного олигосахарида. На рисунке 2 представлены профили различных ЛПС R. leguminosarum и R. etli, изученные с помощью PAGE. У некоторых штаммов число повторов в О- цепи сильно варьирует и PAGE-анализ дает "ступенчатые" профили. Для других штаммов число повторов варьирует слабо, и PAGE-анализ показывает лишь несколько главных полос (Carlson, 1984; Carlson et al, 1983, 1987a, 1987b). Интересно, что О-цепи R. leguminosarum, выделенные после мягкого кислотного гидролиза, имеют остатки Kdo на редуцирующих концах, что не ха­рактерно для энтеробактерий. Структуры цепей штаммов R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. viceae и R. etli представлены в таблице 1. У штамма СЕЗ R. etli (ранее R. leguminosarum bv. phaseoli) повторяющаяся единица О-цепи состоит из глюкуроновой кислоты (GIcA), фукозы (Fuc) и З-О-метилрамнозы (3MeRha) (Carlson et al, 1987a). Даже в присутствии GIcA О-цепь, выделенная после мягкого кислого гидролиза ЛПС, не связывается на колонке DEAE при рН=8.0, что говорит о нейтральности молекулы. Следовательно, карбоксильная группа GIcA должна быть модифицирована таким образом, чтобы обеспечить нейтральность, т.е. GIcA может быть модифицирована в глюкуронамидный остаток. Изучение других структур важно тем, что присутствие О-цепи необходимо для нормального морфогенеза клубеньков, а в процессе развития симбиоза происходят модификации О-цепи (раздел II.F.).

Полная структура корового района липида А штамма СЕЗ R. etli представлена на рисунке 3. Гликозильный компонент состоит из Kdo, глюкозамина, 2-аминоглюконата (GlcNonate), манно- зы (Man), галактозы (Gal) и галактуроновой кислоты. Для двух коровых олигосахаридов, осво­бождаемых при мягком кислотном гидролизе лабильных гликозидов Kdo, были определены струк­турные связи. Они включают a-D-GalA-1—>5[(a-D-GalA-l—>4)]-Kdo трисахарид и a-D-Gal-1—>6[а- D-GalA-l->41-a-D-Man-l->5-Kdo тетрасахарид (Carlson et al, 1990; Bhat et al, 1991a). Идентичные олигосахариды были выявлены в ЛПС R. leguminosarum bv. trifolii и R. leguminosarum bv. viceae (Carlson et al, 1988; Hoollingsworth et al, 1989b, 1990, 1994; Zhang et al, 1992). Важно отметить, что 3- дезоксигептулозаровая кислота также выявлена в коровом районе некоторых штаммов R. leguminosarum bv. trifolii (Russa et al, 1991).

Липид-А из штамма СЕЗ R. etli был выделен при мягком кислотном гидролизе и структурно охарактеризован (Bhat et al, 1994). По сравнению с другими бактериями он имеет очень необыч­ную структуру. Этот липид А лишен фосфата, не имеет апилоксиацил-замещений, содержит толь­ко гидрокси-жирные кислоты, включая высокомолекулярную 27-гидроксиоктакозониковую кис­лоту (27-ОНС28:0) (Hollingsworth et al, 1989а), в положении 4' находится остаток GalA вместо фосфата, а 2-аминоглюконат — в положении GlcN-1-фосфата. Кроме того, в отличие от липида А энтеробактерий, в котором заместителем N-ацила является исключительно (i-гидроксимиристат, липид-А R. etli содержит GlcN, который гетерогенно N-ацилирован гилроксимиристатом, р- гидроксипальмитатом, либо p-гидроксистеаратом (Bhat et al, 1991с, 1994).

Организация коровых олигосахаридов и точка прикрепления О-цепи в ЛПС были определены путем анализа мутантов, у которых либо полностью отсутствует O-цець, либо она резко укорочена (Carlson et al, 1995; Forsberg, Carlson, 1997) (рис. 3). Важно отметить, что препараты ЛПС пред­ставлены гетерогенной смесью молекул на различных стадиях завершенности биосинтеза. Поэтому препарат ЛПС, лишенного О-цепи, содержит различные коровые структуры, лишенные остатков гексозы или гексуронозила (Forsberg, Carlson, 1997). Полная структура молекулы ЛПС, содержа­щей полисахарид О-цепи, представлена на рисунке 3. Химический анализ ЛПС R. etli показал, что полисахарид О-цепи прикреплен к галактозильному остатку в коровом регионе, то есть к "тетраса- харидному" коровому элементу. Поэтому любое нарушение в этом участке кора приводит к образо­ванию "шероховатого" ЛПС. Это было показано для R. etli (Carlson et al, 1995) и R. leguminosarum bv. viceae (Zhang et al. 1992; Hollingsworth et al, 1994).

To, что галактозильный остаток является точкой прикрепления О-цепи в ЛПС R. leguminosarum, подтверждается тем, что ехоБ-мутант, дефектный по УДФ-галактозо-эпимеразе, лишен полисаха­рида О-цепи ЛПС (Van Workum et al, 1995). Установлено, что ЛПС штамма 4S R. leguminosarum bv. trifolii, лишенный тетрасахаридной части в коровом регионе, не имеет О-цепи полисахарида (Cederberg et al, 1996). В этой же работе показано, что у данного штамма полисахарид О-цепи прикреплен к диацилглицерольному кольцу, а не к коровому региону ЛПС.

II. В. 2. Структура ЛПС других представителей Rhizobiaceae

Структура Л ПС у Agrobacterium изучена слабо. Однако известно, что биотипы 1 и 2 A. tumefaciens содержат О-цепи, обогащенные рамнозой. PAGE-анализ показал, что биотип 3 имеет "шерохова­тый" ЛПС, лишенный полисахарида О-цепи (Weibgen et al, 1993).

В дополнение к указанным выше структурам, была изучена О-цепь ЛПС штамма CIAT899 R. tropici (Gil-Serrano et al, 1995) (табл. 1). Как и в случае О-цепей R. etli и R, leguminosarum, эта структура содержит повторяющийся олигосахарид, богатый дезоксигексозами. Фактически состав многих ризобиальных О-цепей показывает что они богаты дезоксигексозами и метилированными дезоксигексозами и могут также содержать 6-дезокси-аминосахара и N-метилированные 6-дезокси- аминосахара (Carlson, et al, 1978; Zevenhuizen et al, 1980; Carlson, 1982, 1984; Glowacka et al, 1986; Carrion et al, 1990; Weibgen et al, 1993; Russa et al, 1995; Gil-Serrano et al, 1995). Кроме того, использование метода ЯМР показало, что О-цепи могут быть сильно ацетилированы (Carrion et al, 1990; Bhat et al, 1992; Gil-Serrano et al, 1995). Поэтому О-цепи ЛПС ризобий могут быть в отношении полисахарида весьма гидрофобны. О-цепи ЛПС В. japonicum и В. elkanii, которые также содержат дезоксисахара, сильно ацетилированы и, как уже говорилось, в достаточной степени гидрофобны для того чтобы быть выделенными в фенольном слое при водно-фенольной экстрак­ции (Carrion et al, 1990; Bhat et al, 1992).

О-цепи многих видов Rhizobium и Bradyrhizobium являются основными антигенными детерми­нантами. При получении антител против этих бактерий большинство из них оказываются актив­ными против О-цепи полисахарида (Carlson et al, 1987а, 1987b; Carrion et al, 1990). Обычно имеется лишь слабая реакция на "шероховатые" ЛПС, лишенные О-цепи (Lucas et al, 1996).

О-цепи S. fredii, S. meliloti и Rhizobium sp. NGR234 отличаются от О-цепей Rhizobium и Bradyrhizobium. Часто они являются гомополимерами, например глюканами (Reuhs et al, 1994а). Кроме того, у этих видов коровый олигосахарид является основным антигенным районом ЛПС (Reuhs et al, 1993, 1995; Petrovics et al, 1993), т.к. антисыворотка на эти бактерии сильно реаги-

 

Рисунок 3. Структура корового олигосахарида липида-А Rhizobium etli, СЕЗ. Волнистые линии в структуре Kdo означают, что аномерные конфигурации соотвествующих связей не известны (хотя по аналогии со структурами Kdo других бактерий можно предполагать наличие альфа-связей). Кислотолабильные связи указаны стрелками. Kdo - 3-дезокси-О манно-2- окгулозонозил. Gal — галактоза, GalA — галактуроновая кислота, Man - манноза.

рует с "шероховатым" ЛПС. Эти результаты показывают, что О-цепи данных видов не являются сильно антигенными или что соотношение "гладкой" и "шероховатой" форм ЛПС значительно ниже, чем это наблюдают у видов R. leguminosarum, R. etli и Bradyrhizobium. Поэтому высокое содержание "шероховатого" ЛПС на клеточной поверхности S. meliloti, S. fredii и Rhizobium sp. NGR234 делает его доминирующим антигеном. Это же характерно и для R. galegae (Lipsanen et al, 1989) — вида, таксономическое положение которого недостаточно ясно.

Охарактеризованы коровые олигосахариды и некоторых других ризобий. У штамма 61А101с В. elkanii коровый регион состоит из двух олигосахаридов: a-4-0-MeMan-(l—>5)-Kdo дисахарида и а- Man-(l->4)-a-Glc-(l->4)-Kdo трисахарида. Эти олигосахариды освобождаются при мягком кислот­ном гидролизе ЛПС мутантов, лишенных полисахарида О-цепи (Carlson et al, 1992). Из ЛПС родительского штамма освобождаются только трисахариды и О-цепь, содержащая 4-О-МеМап. Поэтому возможно, что полисахарид О-цепи связан с остатком 4-О-МеМап корового региона. В

Таблица 1. Структура О-цепей полисахаридов ризобий. Glc - глюкоза, Man - манноза, ManNAc ~ N-ацетилманнозамин, Rha - рамноза, Tal - талоза, GIcA* - модифицированная ней­тральная глюкуроновая кислота, Fuc - фукоза, Me - метил, Ас - ацетил.

Штамм

Структура

Ссылка

R. leg. bv.

->3)- a-L-Rha-(l>3)- cx-L-Rha-(l->4)- p-D-GlcNAc-(l->3)- a-L-Rha-(l->

Wang et

trifolii 4S

2)

al, 1994

 

T

 

 

ot-D-ManNAc-(l

 

R. leg. bv. viceae

->3)- cc-L-Rha-a->3)- a-L-Fuc-(l>3)- a-L-FuC-(l->

Chen, 1987

128C53

2)

 

 

T

 

 

a-D-Man-(l

 

R. etli

->4)- P-I>GlcA*-(l->4)- a-L-Fuc-(l->

Forsberg et

CE3

3)

al., in

 

t

preparation

 

а-3-O-McRha-l)

 

R. tropici

И)- p-n-Glc-(l->3)- cc-D-2-0-Ac-6-deoxy-Tal-(l->3)- cx-l-Fuc-(1->

Gil-

CIAT899

Serrano et

 

 

al., 1995

отличие от ЛПС R. leguminosarum, ЛПС В. elkanii не содержит в коровом регионе кислых Сахаров, за исключением Kdo.

"Гладкие" и "шероховатые" ЛПС из R. fredii могут быть разделены, и анализ вторых показал, что их коровый район состоит из Kdo, Glc, Gal, GalA, GIcA (Reuhs et al, 1994a). Места присое­динения и последовательность этих гликозильных остатков не были определены. Профили, полу­ченные путем анионной обменной хроматографии с высоким разрешением (НРАЕС) показали высокое сходство "гладкого" и "шероховатого" ЛПС, что говорит об идентичности их коровых структур (Reuhs et al, 1994а). При этом оказалось, что коровые регионы различных штаммов S. fredii имеют общий набор олигосахаридов, а также и второй их набор, который варьирует от штам­ма к штамму (рис. 4В, обсуждение ниже).

ЛПС Sinorhizobium meliloti и Rhizobium sp. NGR234 имеют коровые регионы, весьма сходные с S. fredii (см. следующий раздел). В коровом районе ЛПС S. meliloti содержится необычный сахар, З-дезокси-2-гептулозаровая кислота (Russa et al, 1991, 1996), которая обычно присутствует в компоненте растительной клеточной стенки, называемом рамногалактуронаном II (Stevenson et al, 1988). Этот сахар найден также в коровом компоненте ЛПС Agrobacterium (Weibgen et al, 1993). У S. meliloti данный компонент сульфатирован (Cedergren et al, 1995). Это может быть связано с наличием у S. meliloti нескольких наборов генов, контролирующих сульфатацию, в дополнение к генам nodP, nodQ, nodH, ответственным за сульфатацию липо-хито-олигосахаридных Nod-факто- ров (Schwedock et al, 1992).

Липиды А из ЛПС варьируют по структуре у разных видов ризобий. Гликозильный состав различных регионов липида-А представлен в таблице 2. В дополнение к описанному выше липи- ду-А R. leguminosarum, липид-А S. meliloti состоит из ацилированного бис-фосфорилированного дисахарида глюкозамина, сходного с тем, который был обнаружен у многих энтеробактерий (Urbanik- Sypniewska et al, 1989). Липид-А В. japonicum, В. elkanii, Bradyrhizobium sp. (Lupinus), M. loti содержат 2,3-диаминоглюкозу (Mayer et al, 1989b; Russa et al, 1995). Липид Ay B. elkanii также содержит маннозу (данные авторов), ay М. loti он фосфорилирован (Russa et al, 1995). Детально гликозильный состав липида A Agrobacterium не описан, однако анализ интактного ЛПС показал присутствие глюкозамина (Weibgen et al, 1993).

Таблица 2. Гликозильные компоненты липида А у бактерий Rhizobiaceae

Группа

Вид

GlcN

DAG Man

GalA

2-G1

Pho

Ссылки

1

,S. meliloti

+

-

-

-

+

Urbanik-Sypniewska et al, 1989

 

S. fredii

+

-

-

-

nd

Bhat et al.. 1991c

II

R. teg. bv. trifolii

+

-

+

+

-

Bhat eta), 1991c

 

R. leg. bv.

+

-

+

+

-

Bhat et al, 1991c

 

viceae

 

 

 

 

 

 

 

R. etli

+

-

+

+

-

Bhat et al, 1991c, 1994

III

B. japonicum

B. sp. (Lupinus)

-

+ +

-

-

-

Mayer et al, 1989b Mayer et al, 1989b

IV

B. elkanii

-

+ +

-

-

nd

Данные авторов

V

M. loti

-

+

-

-

+

Russa et al, 1995

GlcN - глюкозам ин, DAG — 2,3-диамитюглтокоза, Man - манноза, GalA - галактуроновая кислота, 2-G1 - 2-аминоглкжонат, Pho — фосфат, nd - нет данных.

Типы жирных кислот, найденные в липидах А ризобий, могут сильно различаться у разных видов (Russa et al, 1985; 1995; Mayer et al, 1989b; Bhat et al, 1991c). Обычно преобладают (3- гидрокси-жирные кислоты, 27-гидроксиоктакозановая кислота, а также выявлены небольшие ко­личества различных насыщенных и моно-ненасыщенных жирных кислот. Некоторые липиды А содержат небольшие количества оксо-жирных кислот (Russa et al, 1995).

II.C. ВАРЬИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ЛПС И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РОДСТВО РАЗЛИЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ RHIZOBIACEAE

Детали структуры корового региона и липида А используют для уточнения филогенетических отношений у разных бактерий (Mayer et al, 1984, 1989а, 1990; Bhat et al, 1991b; Neumann et al, 1995). Филогения, построенная на основе последовательностей 16S или 5S рРНК, обычно корре­лирует со структурой липида-А. Поэтому сравнение структуры ЛПС у различных представителей Rhizobiaceae с известными филогенетическими отношениями представляет большой интерес.

Одним из последних достижений в изучении Л ПС стало выяснение того факта, что липид А R. leguminosarum bv. trifolii содержит, в дополнение к другим жирнокислотным остаткам, очень длинную жирную кислоту, 27-ОНС28:0 (Hollingsworth et al, 1989а), которая затем была найдена и у других представителей Rhizobiaceae за исключением A. caulinodans (последнее требует перепро­верки) (Bhat et al, 1991с). Поскольку на основании гомологии 16S рРНК показано, что семей­ство Rhizobiaceae входит в альфа-подкласс протеобактерий (Woese, 1987), были изучены липиды А и у других членов этой группы, включая фототрофные, нитрифицирующие, клубенькообразую- щие и внутриклеточные бактерии, в том числе патогены растений и животных. Липид А, содер­жащий 27-ОНС28:0, был выделен из Rhodopseudomonas viridis, R. palustris, Nitrobacter winogradskyi, N. hamburgensis, Oligotropha carboxydovorans (ранее Pseudomonas carboxydovotans), Brucella abortus, Afipia felis (ранее известна как бактерия, связанная с болезнью "кошачьих царапин"), A. tumefaciens, A. radiobacter, A. rhizogenes и Thiobacillus spp. (Bhat et al, 1991b).

Изучение гликозильных остатков, найденных в различных липидах А ризобий, выявило ва­рьирование компонентов, различающихся в соответствии с филогенетическим положением (табл.

2). В соответствии с этими данными, изученные виды Rhizobiaceae могут быть разделены на 5 кластеров: (1) S. meliloti, S. fredii; (2) R. leguminosarum (bv. trifolii, viceae, phaseoli), R. etli', (3) B. japonicum, B. sp. (Lupinus)\ (4) B. elkanii; (5) M. loti. Это распределение соответствует результатам других филогенетических исследований (Jarvis et al, 1992; Yanagi et al, 1993; Young et al, 1996; Martinez-Romero et al, 1996). Единственным исключением является недавно реклассифицирован- ный штамм R. leguminosarum bv. phaseoli СЕЗ, включенный в состав R. etli (Segovia et al, 1993). Липиды A R. leguminosarum (bv. trifolii, bv. viceae) и штамма СЕЗ R. etli не только имеют сходный гликозильный состав, но и общую структуру, представленную на рис. 3. По липиду A Agrobacterium информации получено еще недостаточно для того, чтобы включить ее в общую схему (табл. 2).

Связь между структурой ЛПС и филогенией была подтверждена также путем сравнения коровых олигосахаридных районов. В этом случае выявляемые подгруппы те же, что и в случае состава липида А. Путем НРАЕС-анализа ЛПС, гидролизованного мягким кислотным методом, показано, что обычно присутствуют только коровые олигосахариды, так как полисахариды О- цепей элюируются в пустой объем или, при наличии кислотных свойств, намного позднее, чем коровые олигосахариды. На рисунке 4А представлены коровые профили, полученные методом НРАЕС у штаммов СЕЗ R. leguminosarum bv. viceae, ANU843 R. leguminosarum bv. trifolii, которые оказались идентичными. Для этих профилей была определена структура каждого НРАЕС-пика (Carlson et al, 1995). У всех изученных штаммов R. leguminosarum и R. etli коровый район ЛПС состоит из тетра- и трисахаридов (Carlson et al, 1988; Hollingsworth et al, 1990, 1994; Bhat et al, 1991a; Zhang et al, 1992), описанных выше и организованных так, как представлено на рис. 3. Единственным исключением является ЛПС штамма 4S R. leguminosarum bv. trifolii, в котором отсутствует тетрасахаридный компонент кора, а также полисахарид О-цепи (Cedergren et al, 1996). Даже при отсутствии данных о коровых олигосахаридах других Л ПС ризобий, такой НРАЕС- анализ может быть использован для сравнения коровых регионов различных ЛПС. На рисунке 4В представлены НРАЕС-профили штаммов USDA205 S. fredii, Rml021 S. meliloti, NGR234 Rhizobium sp. Они оказались иными, нежели профили R. leguminosarum, но сходными между собой тем, что имеются общие для них олигосахариды. Наличие олигосахаридов, общих для данных видов, подтверждают ранние работы (Elkan, 1992; Martinez-Romero, 1994; Young et al, 1996), показавшие их близкое филогенетическое родство. Структурное сходство коровых участ­ков ЛПС для разных бактерий может быть выявлено также путем гель-электрофореза в полиакри- ламидном геле и иммуноблоттинга. Использование последней методики позволило выявить се­рию моноклональных антител (МАК), специфичных для корового региона ЛПС R. leguminosarum bv. viceae. Все коровые МАК способны связываться с ЛПС любого изученного штамма R. leguminosarum, а также СЕЗ R. etli (Kannenberg et al, 1996; Lucas et al, 1996). Эти данные под­тверждают структурную идентичность коровых районов ЛПС Л. leguminosarum и R. etli. В случае штаммов S. fredii, S. meliloti, NGR234 Rhizobium sp. поликлональная антисыворотка против лю­бого из них активно реагирует с "шероховатой" формой ЛПС (ЛПС-2). С использованием поли- клональной антисыворотки, приготовленной против штаммов USDA205 R. fredii или Rm41 S. meliloti, штаммы этих видов могут быть разделены на 4 группы, основанные на реактивности их "шероховатых" ЛПС (табл. 3). На основании этих результатов можно предсказать, что дальней­шее изучение 16S рРНК S. meliloti и Л', fredii позволит разделить их на 4 филогенетически род­ственные группы. В настоящее время проводится работа по изучению связи между НРАЕС- профилями и филогенетическим родством других видов: В. japonicum, В. elkanii, R. tropici, М. loti, A. tumefaciens.

II.D. БИОСИНТЕЗ ЛИПИДА-А У R. ETLI И R. LEGUMINOSARUM

Биосинтез липида-А в ЛПС очень важен для выживаемости Е. coli (Raetz et al, 1990, 1993; Sirisena et al, 1992). Эта часть ЛПС у энтеробактерий отвечает за токсичность, определяемую гиперстимуляцией имунной системы хозяина, например, продуцированием летальных количеств опухолевого некрозного фактора или других цитокининов (Rietschel et al, 1990, 1992, 1993, 1994; Takada et al, 1992). Для токсичности важны структурные особенности липида-А, включая при-

А

R. etli

 

R. leg. bv. viciae R. leg. bv. trifolii

 

r

10

r 15

^aJ

 

 

 

r- 20

i

35

25

30

МИНУТЫ

ooc

 

ooc

 

ЛПС I

1л л . .

L          г лЛ

 

•ЧА!

ЛПС II

w

 

kj V

15

20

r

25

30 35 МИНУТЫ

I

40

—i 45

Рисунок 4. Анализ коровой части липополисахаридов.

A: Rhizobium etli, штамм СТЗ (вверху), R. leguminosarum bv. viceae, штамм 3841 (в центре) и R. leguminosarum bv. trifolii, ANLI843 (внизу). Анализ проводили путем анионной обменной хроматографии высокого разрешениея (НРАЕС). I - мономеры Kdo, 2 - мономеры GalA, 3 - тетрасахарид, 4 - тетрасахарид с остатком Kdo, 5 - трисахарид. В: R. fredii USDA205 (вверху), Rhizobium sp. NGR234 (в центре), Sinorhizobium meliloti Rml02! (внизу). Выделены общие олигосахариды, содержащиеся во всех типах ЛПС (ООС), а также олигосахариды, специфичные для ЛПС-1 и ЛПС-2.

Таблица 3. Серогруппы ЛПС-2 у разных видов ризобий, определенные с помощью поликлональной антисыворотки, полученной против штаммов USDA205 S. fredii (SF) или Rm41 S. meliloti (SM). "+" — положительная реакция, "-" — отрицательная реакция, "+/-" — слабая положительная реакция

Группа

Вид

Штаммы

SF

SM

I

S. fredii

USDA205, USDA208, USDA191

+

 

 

Rhizobium sp.

NGR234

 

II

S. fredii S. meliloti

USDA257, USDA201, USDA192, USDA196, USDA197, HH103

NRG133, NRG247, NRG286, AIC631, Rml021, NRG185

 

+

III

S. meliloti

NRG23, NRG53

+/-

+/-

IV

S. fredii

HH303

-

-

сутствие дисахаридного глюкозаминового скелета, фосфатных групп и некоторых остатков жирных кислот. Интерес к изучению липида-А R. leguminosarum определяется его уникальной структурой. Биосинтез липида-А у Е. coli, важного для выживания этих бактерий, изучен подробно (Raetz, 1990, 1993; Clementz et al, 1996, 1997). С использованием различных предшественников липида- А Е. coli показано, что R. leguminosarum имеет те же ферментативные активности, которые у Е. coli определяют синтез Kdo2lipid-IVA (предшественник липида А у Е. coli) из UDP-GlcNAc (Price et al, 1994) (рис. 5). У Е. coli реакции биосинтеза Kdo2lipid-IV важны для выживаемости клеток (Raetz et al, 1990, 1993; Sirisena et al, 1992), а присутствие 4-фосфата необходимо для переноса двух остатков Kdo на липид-1Уд от CMP-Kdo, катализируемого Kdo-трансферазой (Brozek et al, 1989; Belunis et al, 1992). После синтеза Kdo2lipid-IV происходит присоединение ацилоксиациловых жирных кислот и формируется зрелый липид-А Е. coli. Это показывает, что R. leguminosarum син­тезирует близкий структурный аналог Kdo2lipid-IVA, а значит стадии биосинтеза Kdo2lipid-lVA важны для выживаемости широкого круга грам-отрицательных бактерий.

Представленные данные показывают, что R. leguminosarum обладает уникальными фер­ментами для превращения предшественника Kdo2lipid-IVA в зрелую структуру липида-А (рис. 5). Это позволяет предположить, что R. leguminosarum не имеет ацилирующих ферментов для формирования ацилоксиацильных заместителей, а имеет 4'- и 1-фосфатазы, систему окисле­ния, обеспечивающую превращение редуцирующего конца глюкозамина в 2-аминоглкжонат, трансферазу, которая переносит галактуронозильный остаток в положение 4', а также уни­кальную ацил-трансферазную систему для включения 27-ОНС28:0. Недавно у R. leguminosarum была выявлена 4'-фосфатазная активность (Price et al, 1995). Соответствующий фермент вы­явлен у штамма СЕЗ R. etli и у нескольких штаммов R. leguminosarum, но не у Е. coli. Эта фосфатаза обладает предпочтением к Kdo в форме I<do.,lipid-IVA как к эффективному субстра­ту, но не липида-1Уд, и связана с мембраной. В другой работе у R. leguminosarum описано присутствие 1-фосфатазной активности (Brozek et al, 1996b). Как и предполагалось, клеточ­ные экстракты R. leguminosarum не имеют ацилирующей активности для формирования ацилок­сиацильных групп. Кроме того, недавно у R. leguminosarum выделен уникальный фермент, необходимый для переноса 27-ОНС28:0 на I<do2lipid-IVA (Brozek et al, 1996a). Этот фермент кодируется открытой рамкой считывания (orf*) — Ips-геном, который был ранее выявлен и частично охарактеризован (Selbitschka et al, 1991). Хотя некоторые ферменты биосинтеза ли­пида A R. leguminosarum были выявлены, другая информация о генах, кодирующих эти фер­менты, не опубликована. В настоящее время продолжается работа по изучению биосинтеза липида A R. leguminosarum.

UDP-GlcNAc

 

Рисунок 5. Схема биосинтеза липида-А (UDP-GlcANc—2-аминоглюконат).

1 — стадии, общие для Escherichia coli, Rhizobium etli и R. leguminosarum. З-О-ацилирование (контролируется геном IpxA), де-М-ацетилирование (lpxC=envA), N-ацилирование (!pxD=firA), синтаза дисахаридов (IpxB), 4' — фосфорилирование (киназа), Kdo-трансфераза (kdtA).

2.         Ферменты, выявленные у Е. coli: лаурил ацилтрансфераза (htrfi), миристил ацилтрансфераза (tnsbB).

3.         Ферменты, специфичные для Rhizobium etli и R. leguminosarum-. 4'-фосфатаза, 1-фосфатаза, 27-гидроксилоктакозано- ил-трансфераза, 4'-галактуронозил-трансфераза, система окисления глюкозаминозила.

II.Е. ГЕНЕТИКА СИНТЕЗА ЛПС У RHIZOBIUM

Генетика биосинтеза ЛПС изучена у R leguminosarum и R. etli. У штамма СЕЗ R. etli выявлен ряд //я-локусов (a, b, 1) (Cava et al, 1989, 1990; Noel, 1992). p-регион расположен на "несимби- отической" плазмиде (Cava et al, 1989, 1990; Brom et al, 1992; Garcia-de los Santos, Brom, 1997), а другие регионы - на хромосоме, а-регион вовлечен в синтез корового олигосахарида и полисаха­рида О-цепи и состоит из 9 различных групп комплементации (от А до I) общим размером 17 т.п.н. (Tao et al, 1992; Carlson et al, 1995). Мутации в комплементационных группах A-F влияют на синтез О-цепи, поскольку мутанты обычно содержат полную коровую структуру, но редуцирован­ную О-цепь. Мутации в группах G-I влияют на синтез корового олигосахарида. Регионы b и 1 необходимы для синтеза корового олигосахарида. Мутации в любом из этих двух регионов приво­дят к полному отсутствию О-цепи в ЛПС (Cava et al, 1989, 1990; Bhat et al, 1991a; Brom et al, 1992). У энтеробактерий, таких как £. coli и Salmonella, гены для биосинтеза кора расположены кластером в д/я-районе хромосомы, а для синтеза полисахарида О-цепи — в //7>районе хромосомы (Schnaitman et al, 1993). Таким образом, расположение //«-генов у штамма СЕЗ R. etli иное, нежели у Е. coli и Salmonella (Cava et al, 1990).

Районы хромосомы, ответственные за образование полисахаридов О-цепей, выявлены и у других штаммов R. leguminosarum bv. viceae (Priefer, 1989; de Maagd et al, 1989b; Kannenberg et al, 1992) и R. leguminosarum bv. trifolii (Brink et al, 1990). У мутанта штамма ANU843 R. leguminosarum bv. trifolii выявлена комплементация а-регионом штамма СЕЗ R. etli, что приводило к синтезу О- цепи, характерной для второго, но не для первого штамма. Это подтверждает приведенные выше структурные данные о том, что коровые районы ЛПС R. leguminosarum и R. etli, являющиеся акцеп­торами О-цепи, имеют сходные структуры.

В дополнение к а-, р-, и 1-регионам, у R. etli был выявлен дополнительный регион, необхо­димый для синтеза "гладкого" ЛПС, т.к. мутации в нем приводят к образованию только "шерохо­ватого" ЛПС (Poole et al, 1994; Allaway et al, 1996). Этот //«-район состоит из г/сменов, участву­ющих в транспорте дикарбоновых кислот. Один из полученных мутантов лишен терминального остатка Kdo, присоединенного к 0-6 корового галактозильного остатка (Allaway et al, 1996).

Таким образом, необходимо дальнейшее изучение генетики синтеза ЛПС у R. leguminosarum. Особый интерес представляют гены, которые контролируют превращение предшественника Kdo2lipid-IVA в липид А. Возможно, эти гены не нужны для выживания клеток, а значит возмож­но получение мутантов, в которых ЛПС содержит липид А, который фосфорилирован, но не имеет жирной кислоты 27-ОНС28:0 (например, мутант orf ) или не содержит галактуронозильного ос­татка в позиции 4'. Исходя из важности бактериальной мембраны в симбиозе, представляет инте­рес изучение действия таких мутаций на коровый район, присутствие О-цепи и на инфицирование растений.

II.F. СТРУКТУРНОЕ ВАРЬИРОВАНИЕ ЛПС РИЗОБИЙ ПРИ РАЗВИТИИ СИМБИОТИЧЕСКИХ КЛУБЕНЬКОВ

Первые работы по изучению Л ПС ризобий проводились с использованием химических (Carlson et al, 1978; Carlson, 1982, 1984) и биохимических (Dazzo et al, 1979, Kamberger, 1979) методов. Химический подход позволил вскрыть описанную выше структуру ЛПС Rhizobium. Его биохими­ческие свойства менее понятны и привлекают наибольшее внимание современных исследователей. Сочетание генетических, иммунохимических, цитологических и иммуноцитологических подходов позволило подойти к пониманию роли ЛПС в симбиозе.

II.F. 1. ЛПС Rhizobium и его структурные адаптации в клубеньках и у свободноживущих бактерий

Детальное биохимическое изучение экспрессии ЛПС у свободноживущих бактерий и у бакте­рий в клубеньках позволило выявить изменения ЛПС, происходящие в процессе симбиоза. По­

скольку растение предоставляет микробу серию очень разных микрониш, логично ожидать наличия у бактерий различных поверхностных адаптаций. Изучение патогенов животных показало, что их ЛПС структурно меняются в зависимости от условий (Proctor et al, 1995). В связи с этим в настоящее время проводится интенсивное изучение структурных модификаций и адаптаций ЛПС ризобий.

Изучение этой проблемы проводилось с помощью наборов моноклональных антител (МАК), специфичных к О-цепям ЛПС (Johabsen et al, 1984; Brewin et al, 1986; Bradley et al, 1988; de Maagd et al, 1989a; Wright, 1990; Sindhu et al, 1990; Tao et al, 1992; Kannenberg et al, 1992, 1994c; Olsen et al, 1994) или на коровую структуру ЛПС (Lucas et al, 1996). Эти МАК используются в качестве молекулярных проб для выявления тонких изменений в структуре ЛПС, происходящих при симби­озе, а также при воздействии на свободноживущие бактерии факторов, моделирующих условия внутри клубенька.

Экспрессия эпитопов ЛПС у ризобий в чистой культуре и в клубеньках. Использование MAC показало изменения эпитопного состава ЛПС в процессе симбиоза. Эти изменения касаются 0- цепей. Дифференциальная экспрессия эпитопов наблюдается при изменении условий роста сво­бодноживущих ризобий, а также при их переходе к симбиозу. Показано, что в зависимости от условий у ризобий могут экспрессироваться различные типы ЭПС (Brewin et al, 1986; Bradley et al, 1988; Kannenberg et al, 1989, 1992, 1994c; VandenBosch et al, 1989; Wood et al, 1989; Sindhu et al, 1990; Tao et al, 1992; Olsen et al, 1994). Экспрессия эпитопов ЛПС была изучена достаточно полно у R. leguminosarum и R. etli. Эпитопы ЛПС либо синтезируются конститутивно, либо их синтез регулируется. Для регулируемых эпитопов экспрессия регулируется в зависимости от внешних ус­ловий. Проведенные исследования позволили сгруппировать эпитопы ризобий в несколько клас­сов. Один из классов регулируемых эпитопов предпочтительно экспрессируется при росте ризобий в чистой культуре, тогда как другой класс - преимущественно в клубеньках (VandenBosch et al, 1989; Sindhu et al, 1990; Tao et al, 1992; Kannenberg et al, 1992, 1994c).

Для того чтобы выявить действие различных хозяев на экспрессию ЛПС, были использованы пары изогенных штаммов R. leguminosarum, различающихся только по присутствию определенных ■Sym-плазмид, одна из которых обеспечивала симбиоз с горохом, а другая — симбиоз с фасолью (Sindhu et al, 1990). В условиях чистой культуры ЛПС этих штаммов не обнаруживали различий, однако у ризобий, выделенных из клубеньков, ЛПС различались как для разных штаммов, так и для бактерий в чистой культуре и в клубеньках. Анализ симбиотических изменений эпитопов у двух пар серологически независимых штаммов R. leguminosarum показал, что они не являются индивиду­альными для каждого штамма. Таким образом, ризобии, которые в чистой культуре синтезируют сходные или идентичные ЛПС, в различных хозяевах, например, в фасоли и горохе, проявляют зависимые от растения модификации ЛПС. Возможно также, что эти модификации зависят не столько от вида растений, сколько от типа клубеньков: детерминированных (фасоль) или недетер­минированных (горох). В любом случае, структура клубеньков определяется в конечном итоге условиями и внутренними сигналами, детальное изучение которых в настоящее время привлекает большое внимание.

Структурные адаптации ЛПС при развитии клубеньков гороха. В клубеньках гороха, индуци­рованных штаммом 3841 R. leguminosarum, впервые было показано, что эпитоп, индуцируемый в О-цепи (узнаваемый МАС203) экспрессируется в бактероидах после их перехода в растительную цитоплазму и включения в симбиосомы, но до экспрессии нитрогеназы (VandenBosch et al, 1989; рис. 6С, 6F). С использованием панели антител, специфичных к эпитопам О-цепи ЛПС, была получена достаточно полная картина экспрессии эпитопов в клубеньках гороха (Kannenberg et al, 1994с). Конститутивно экспрессируемые эпитопы, как и ожидалось, выявляются на всех стадиях развития клубеньков (рис. 6В). Регулируемые эпитопы проявляли два разных типа экспрессии по отношению к продольной оси клубенька: а) радиальный характер экспрессии (рис. 6С) или отсут­ствие экспрессии (рис. 6D); б) меридиональный характер экспрессии (рис. 6Е). Для сравнения на рисунке 6F показана экспрессия нитрогеназы, которая распределяется меридионально. В клу­беньках гороха серологически неродственные штаммы R. leguminosarum давали качественно сход-

 

3

MAC 57

с

ЩЩ

MAC 203

D

ОtJ'i *

MAC 332

E ^^^^^^

MAC 301

F ^^^^

NITROGENASE                    -IW

Рисунок 6. Продольные срезы трехнедельных клубеньков гороха. А - срез клубенька, образованного штаммом Rhizobium bT'ZT R Т'е 3841 ДИКОГ° ™Па' ценный толуидиновым синим (ш - апикальная мериГмаТ-^Г СР£ЗЫ' обрабтан"ь|е антителами, указанными на рисунке (F - антись,воротка против нитрогеназы).

ную картину экспрессии эпитопов (Kannenberg et al, 1994с), которая говорила о том, это состав ЛПС не варьирует случайно в зависимости от индивидуального штамма.

Наблюдаемые изменения в экспрессии эпитопов ЛПС показывают, что наиболее значимые из них происходят после перехода бактерий в симбиосому и при размножении бактерий (VandenBosch et al, 1989). Эти данные показывают, что ЛПС, синтезируемые у бактерий в инфекционных нитях, сходны с ЛПС свободноживущих бактерий. Варьирование экспрессии эпитопов наблюда­лось также при переходе в состояние зрелых бактероидов и на более поздних стадиях развития клубеньков (Kannenberg et al, 1994с).

Резкие изменения экспрессии эпитопов ЛПС in planta (VandenBosch et al, 1989; Goosen-de Roo et al, 1991; Kannenberg et al, 1994c) дают основание сомневаться в том, что при этом проис­ходит синтез новых молекул ЛПС. При изучении ЛПС R. leguminosarum в клубеньках Vicia sativa было показано, что состав эпитопов меняется скачкообразно при эндоцитозе бактериальных кле­ток (Goosen-de Roo et al, 1991). Авторы предполагают, что это связано с быстрой деградацией или модификацией эпитопов ЛПС-1, а не с синтезом новых молекул.

Механизм регуляции эпитопного состава остается неясным. Отмечено, что радиально эксп- рессируемые эпитопы отражают локальные различия физиологических условиях в клубеньках, ко­торым подвергаются эндосимбиотические бактерии (Kannenberg et al, 1994с). В частности, раз­личия в количестве кислорода, поставляемого к бактероидам, может играть важную роль, так как изменения эпитопного состава коррелируют с концентрацией кислорода (Witty et al, 1986). По меньшей мере, один из эпитопов, экспрессируемых вдоль продольной оси развития, связан с созреванием бактероидов и экспрессией нитрогеназы (известно, что ризобии, не способные эксп- рессировать этот эпитоп, не могут осуществлять нормальный инфекционный процесс). Поскольку варьирование эпитопов ЛПС не ограничено определенным этапом симбиоза, а происходит на всех стадиях развития клубеньков гороха, очевидно, что многие факторы связаны с регуляцией и про­дукцией различных структурных модификаций. Структуры различных эпитопов ЛПС, экспресси­руемых в клубеньках, до сих пор неясны.

Экспрессия эпитопов ЛПС in vitro. Имеется много данных о механизмах экспрессии эпитопов и структурной адаптации ЛПС. Ризобии можно культивировать при различных условиях и изучать их действие на состав эпитопов. У штамма 3841 R. leguminosarum экспрессию эпитопов ЛПС изуча­ли при росте в кислой среде и при разных концентрациях кислорода. В обоих случаях наблюдали экспрессию одних эпитопов и исчезновение других (Kannenberg et al, 1989, 1992, 1994с; Sindhu et al, 1990), что говорит об участии физиологических факторов в экспрессии эпитопов. В другой работе было показано, что бактероиды штамма СЕЗ R. etli слабо реагируют с моноклональными антителами, которые обычно хорошо реагируют с бактериями, выращенными в лабораторных условиях. Сходная реактивность выявлена для ЛПС бактерий, выращенных при некоторых особых режимах: кислая среда, высокая температура, низкая концентрация фосфата и кислорода (Tao et al, 1992). У штамма 3841 R. leguminosarum при культивировании на сложной среде с пониженным содержанием кислорода и близкой к нейтральной реакции экспрессия эпитопов у свободноживу­щих бактерий была близка к их экспрессии у бактероидов (Kannenberg et al, 1992).

Не все эпитопы ЛПС, которые коррелируют с различными стадиями развития, могут при определенных условиях экспрессироваться в лабораторной культуре (Kannenberg et al, 1994с). По- видимому, растительные сигналы могут участвовать в экспрессии этих эпитопов. Недавно это было показано для штаммов S. fredii, эпитопный состав которых меняется при добавлении в среду расти­тельных эксудатов (Reuhs et al, 1994а). У R. etli был выявлен эпитоп ЛПС, который супрессирует- ся при добавлении эксудата семян (Noel et al, 1996b). Активное соединение было охарактеризова­но как антоцианин (Noel et al, 1996а; Duelli, Noel, 1997). Таким образом, экспрессия ЛПС и молекулярная адаптация могут определяться как физиологическим условиями, так и растительны­ми сигналами.

Было изучено и действие на модификацию ЛПС почвенных условий. Солеустойчивый штамм S. meliloti, выделенный из клубеньков растения Melilotus, растущего в засоленной почве Испании (Lloret et al, 1995) имел измененную молекулярную массу и антигенные свойства ЛПС, связан­ные с ионным стрессом и осмотическим давлением. По-видимому, ризобии проявляют суще­

ственную гетерогенность ЛПС в различных микроусловиях, связанных не только с растением, но и с адаптациями к локальным условиям почвы.

Химическое изучение структурной адаптации ЛПС. Структурная основа адаптации ЛПС в от­вет на действие различных физиологических факторов до сих пор адекватно не изучена. Показано, что О-цепь ЛПС штамма СЕЗ R. etli (производный штамма CFN42), выращенного при рН=4.8, имеет измененный характер метилирования. Это изменение коррелирует со слабым связыванием двух моноклональных антител с ЛПС бактерий, выращенных в кислой среде, по сравнению с бактериями, выращенными в нейтральной среде. Сходное изменение метилирования наблюдается и у бактерий, выделенных из клубеньков (Bhat et al, 1992). Также был изучен ЛПС у штамма 3841 R. leguminosarum, выращенного в чистой культуре и выделенного из клубеньков. С использованием метода водно-фенольной экстракции показано, что ЛПС свободноживущих бактерий переходит в основном в водную фазу, а ЛПС из клубеньковых изолятов в равной степени распределяется между обеими фазами. Таким образом, ЛПС, экспрессирующийся у бактерий в клубеньках, более гид- рофобен, чем ЛПС бактерий в чистой культуре. Частичная химическая характеристика ЛПС пока­зала, что различия в гидрофобности могут быть связаны с углеводной частью молекулы а также с различным содержанием жирных кислот с длинной цепью (Kannenberg et al, 1994b).

II.F.2. JIПС-мутанты ризобий и развитие клубеньков

Изучение симбиотических фенотипов у мутантов позволило подойти к пониманию функ­ций, выполняемых ЛПС при развитии клубеньков. Большинство ЛПС-мутантов Rhizobium сохра­няет способность к образованию клубеньков (Noel, 1992), однако структура этих клубеньков часто нарушена (Noel et al, 1986; Priefer, 1989; de Maagd et al, 1989b; Chapman et al, 1990; Stacey et al, 1991; Kannenberg et al, 1992; Niehaus et al, 1994; Lopez-Lara et al, 1995). Эти нарушения обычно выражаются в отсутствии или резком снижении азотфиксирующей активности. Мутанты, характе­ризующиеся неполным развитием клубеньков, часто обозначают Ndv (от англ.: nodule development).

Наиболее сильные фенотипические нарушения характерны для ЛПС-мутантов при образова­нии детерминированных клубеньков. Например, мутант штамма 62А101с В. elkanii, лишенный О- цепи ЛПС, проявляет, в зависимости от сорта сои, несколько разных фенотипов (Stacey et al, 1991). На одних сортах этот мутант вообще не образует клубеньков. На других сортах он образует пустые вздутия или каллусоподобные структуры, в которых отсутствует инвазия бактерий и инфек­ционные нити, а также имеется центральный проводящий пучок (а не периферийный как в нор­мальных клубеньках) и наблюдается локализованная гибель эпидермальных клеток. Описан не образующий клубеньков мутант штамма USDA110 В. japonicum, лишенный О-цепи ЛПС, но име­ющий дополнительную модификацию клеточной поверхности (van de Wiel et al, 1990). Невиру­лентный мутант В. elkanii (штамм 61А76) лишен некоторых Сахаров в О-цепи (Maier et al, 1978).

Мутанты R. etli, лишенные полисахарида О-цепи ЛПС, симбиотически дефектны: они обра­зуют мелкие белые клубеньки на фасоли (которая, как и соя, образует детерминированные клу­беньки), лишенные легоглобина (Noel et al, 1986). В них образуется меристема и в течение пер­вых дней развитие происходит нормально, однако затем начинается формирование центрального проводящего пучка. Инфекция является абортивной, и инфекционные нити, блокируемые в кор­невых волосках, резко отличаются по структуре от нормальных инфекционных нитей. По составу белков эти аномальные клубеньки гораздо ближе к неинокулированным корням, чем к нормаль­ным клубенькам. Молекулярная основа этих нарушений развития клубеньков неясна. И наконец, не было получено ЛПС-мутантов ризобий, которые обеспечивают нормальную инфекцию детер­минированных клубеньков, что затрудняет оценку роли ЛПС на более поздних стадиях их развития.

ЛПС-мутанты штаммов R. leguminosarum bv. viceae, образующих недетерминированные клу­беньки на растениях гороха и вики, характеризуются отсутствием О-цепи в ЛПС, аномальной структурой инфекционных нитей и спорадическим эндоцитозом бактерий в растительные клетки (de Maagd et al, 1989b; Priefer, 1989; Perotto et al, 1994). Бактероиды быстро стареют и фиксируют мало азота. Мутант штамма ANU843 R. leguminosarum bv. trifolii, лишенный О-цепи ЛПС, образует на клевере недетерминированные клубеньки со сходными нарушениями (Chapman et al, 1990). Детальный цитологический анализ клубеньков гороха показал, что стенки инфекционных нитей

вторично модифицированы и, возможно, имеют отложения каллозы. Последняя накапливается в межклеточном матриксе, состоящем в основном из растительных гликопротеинов. Эти модифика­ции могут быть связаны с индукцией умеренных защитных реакций у растений (Perotto el al, 1994). JlПС-мутанты ризобий гороха при эндоцитозе в растительные клетки образуют аномально скрученные и удлиненные бактероиды (рис. 7). Деление бактерий нарушено, и его синхронизация с делением перибактероидной мембраны (ПБМ) отсутствует — нарушение, характерное для разви­тия недетерминированных клубеньков (Perotto et al, 1994).

Данные о симбиотических свойствах ЛПС-мутантов S. meliloti противоречивы. Одни авторы показали, что ЛПС-мутанты штамма SU47 S. meliloti в большинстве своем образуют на люцерне нормальные клубеньки (Clover et al, 1989). Однако, эти мутанты не были охарактеризованы хи­мически. PAGE-анализ экстрактов ЛПС показал его измененную подвижность. Все мутанты со­держат Л ПС-1 и ЛПС-2. У штамма Rm2011 S. meliloti был получен мутант, с измененной О-цепыо ЛПС (Lagares et al, 1992). Он обладает сниженной интенсивностью образования клубеньков на главном корне многолетней люцерны (Medicago sativa) и нарушенной нодуляционной конкурен­тоспособностью. На однолетней люцерне (М. truncatula) этот мутант формировал аномальные клу­беньки (Niehaus et al, 1994), в которых бактерии выходили из инфекционных нитей, однако они не могли размножаться в цитоплазме, где формировались многочисленные везикулы. На свежих срезах наблюдали коричневые некротические зоны в центральной части клубенька. Таким обра­зом, этот фенотип сходен с тем, что выявлено для ЛПС-мутантов R. leguminosarum. Мутанты S. meliloti и S. fredii, полностью лишенные О-цепи, еще не описаны. В то же время, имеется ряд указаний на то, что по составу поверхностных молекул Sinorhizobium отличается от других ризобий, что также осложняет анализ структурно-функциональных особенностей этих компонентов (разд. II.B.2.).

Имеются данные о симбиотических функциях еще трех классов ЛПС-мутантов ризобий. Один из классов имеет сильно редуцированную О-цепь, но не лишен ее полностью. При инокуляции гороха и фасоли эти мутанты проявляют такой же фенотип, что и мутанты, полностью лишенные О-цепи (de Maagd et al, 1989b; Cava et al, 1989; Kannenberg et al, 1992; Perotto et al, 1994). Таким образом, наличие одного или немногих повторяющихся единиц в О-цепи не может восста­новить симбиотические свойства. Второй класс мутантов образует сниженное в три раза количе­ство ЛПС-1 (Cava et al, 1989). Эти мутанты имеют те же фенотипические дефекты, что и мутан­ты, полностью лишенные ЛПС-I. Эти данные говорят против того, что ЛПС выполняют сигналь­ные функции, так как в этом случае для сохранения функций достаточно небольшого количества ЛПС. Однако, такое заключение может оказаться преждевременным по двум причинам. Структу­ра ЛПС, экспрессируемого в лабораторных условиях, может быть иная, чем ЛПС, экспрессируе- мого в клубеньках. Кроме того, изученный мутант лишен хиновозамина — сахара, в норме присут­ствующего в О-цепи (Tao et al, 1992). Поэтому мутация может иметь плейотропный эффект, изменяя как структуру, так и количество ЛПС-1. Третий класс мутантов синтезирует О-цепи с резко измененной структурой (Brink et al, 1990; Kannenberg et al, 1992). Они так же эффективны в симбиозе, как и исходный штамм, что говорит против участия структуры О-цепи в развитии клубеньков. Однако возможно, что О-цепь служит основой для более специфических модифика­ций структуры, например, присоединения ацетильных или метальных групп, а также разветвлен­ных Сахаров, что может быть важным для развития инфекции. Эта линия рассуждений позволяет предположить существование класса ферментов, которые модифицируют определенные сахара в О-цепи вне зависимости от ее специфической структуры.

Довольно трудно сделать однозначные выводы о структурно-функциональных связях между ЛПС и симбиотическими свойствами ризобий. Во-первых, мутации, приводящие к значительным нарушениям структуры ЛПС, могут оказывать плейотропное действие на архитектонику всей кле­точной поверхности. Полное отсутствие полисахарида О-цепи влияет и на другие мембранные компоненты - коровую часть ЛПС, белки, различные углеводы (например, К-антигены). Взаи­модействие этих компонентов с поверхностью растительной клетки может быть причиной наруше­ния симбиотических свойств у мутантов. Эти мутанты могут иметь ослабленную мембрану с изме­ненной пропускающей способностью, что приводит к неблагоприятным для симбиоза изменениям

 

 

Рисунок 7. Ультраструктура 4-нсдельного клубенька гороха, образованного мутантом штамма 3841 Rhizobium leguminosarum bv. viceae, дефектным по синтезу липопсшисахаридов. А — срез клубенька, окрашенный толуидиновым синим (редкие бактероиды отмечены звездочками). В — инвазионные структуры, С — бактероиды мутанта, F — бактероиды дикого типа, D, Е, G - множественно инфицированные симбиосомы (Perotto et al, 1994).

в обмене молекулами. Кроме того, резкие изменения ЛПС могут компенсироваться модификацией или синтезом других поверхностных компонентов. Действительно, у одного из ЛПС-мутантов R. leguminosarum выявлено резкое увеличение количества р-2-связанного глюкана и 10-кратное сниже­ние количества нейтрального капсульного полисахарида (Breedveld et al, 1993). Несмотря на эти сложности, полученные результаты позволили создать представление о важности структуры ЛПС для проявления симбиотических свойств. Для их полного проявления необходима нормальная струк­тура ЛПС, включающая необходимый размер О-цепи, коровый олигосахарид, липид А, а воз­можно и определенное количество ЛПС (Noel, 1992; Kannenberg et al, 1992).

II.F.3. Возможная роль ЛПС в развитии клубеньков

В процессе становления симбиоза ризобии должны модулировать развитие растений, избе­гать действия защитных реакций, а также сохранять свою жизнеспособность. Функции ЛПС в осуществлении этих сторон симбиотического взаимодействия окончательно не ясны. В этом раз­деле мы рассмотрим возможную роль ЛПС на следующих стадиях развития клубеньков: инициация инфекции, инвазия тканей клубенька, эндоцитоз бактерий, развитие и старение бактероидов.

Инициация инфекции. Инициация развития инфекционных нитей требует не только образо­вания LCO, но и присутствия жизнеспособных клеток ризобий в сайте инфекции (Kijne, 1990; Brewin, 1991; van Spronsen et al, 1994). Последнее еще не получило полного объяснения, однако тесный контакт растительных и бактериальных поверхностных компонентов может быть необходи­мым для формирования инфекционной нити, а также для прикрепления ризобий к корневым волоскам, важного для инициации этого процесса (Kijne et al, 1992).

Тот факт, что большинство ЛПС-мутантов ризобий способно инфицировать растительные ткани, не подтверждает того, что ЛПС абсолютно необходим для инициации инфекции. Однако было показано, что ЛПС штамма 0403 R. leguminosarum bv. trifolii быстро связывается с кончиками корневых волосков клевера и индуцирует формирование инфекционной нити (Dazzo et al, 1991). Этот эффект не был получен при использовании ЛПС из гетерологичных бактерий. Хотя данные работы и говорят о специфическом взаимодействии партнеров с участием ЛПС, его механизм неясен. Имеются и другие косвенные доказательства участия ЛПС в прикреплении. Во-первых, ЛПС-мутанты Bradyrhizobium не способны к образованию клубеньков, что говорит о возможной роли ЛПС в формировании инфекционных нитей при развитии детерминированных клубеньков у сои. Во-вторых, ЛПС-мутант S. meliloti имеет сниженную инфекционность при образовании неде­терминированных клубеньков у люцерны, что может обусловливать потерю конкурентоспособнос­ти (Lagares et al, 1992).

Инвазия тканей корня. В целом, инвазия тканей корня ЛПС-мутантами в большей степени нарушена при образовании детерминированных, чем недетерминированных клубеньков. Для пер­вого типа клубеньков часто наблюдают некрозы и отмирание клеток, что говорит об активации защитных реакций хозяина (Noel et al, 1986; Stacey et al, 1991). Причины этого различия между двумя типами клубеньков неясны (раздел 1I.F.2.), но они могут отражать различия в микроокруже­нии бактериальных клеток, изменения барьерных свойств клеточных стенок, а возможно и тонкие воздействия ЛПС на растение.

Возможно, различия в фенотипах ЛПС-мутантов отражают разные пути инфекции (Brewin, 1991). В случае недетерминированных клубеньков ЛПС-зависимые модификации влияют главным образом на эндоцитоз бактерий и развитие бактероидов, что выражается в остановке развития симбиоза на относительно поздних стадиях. Возможно также, что в детерминированных клубень­ках тесный контакт бактериальных и растительных клеточных поверхностей может играть решаю­щую роль, либо свободное пространство внутри инфекционной нити столь мало, что в нем созда­ются высокие концентрации антимикробных факторов, например, фитоалексинов. Фенотипы ЛПС- мутантов ризобий могут быть объяснены действием на них токсичных веществ, вызывающих абор- тацию инфекционных нитей. Показано, что некоторые мутанты штамма СЕЗ R. etli, лишенные О- цепи ЛПС, более чувствительны к действию корневых экстрактов (Eisen et al, 1994). Однако, значимость этого факта неясна, так как другой ЛПС-мутант (также дефектный по развитию клу­беньков) не имел повышенной чувствительности к корневым экстрактам. Фенотипы ЛПС-мутан-

тов на хозяевах, образующих детерминированные клубеньки, сходны с теми, что описаны для ЭПС-дефектных мутантов на растениях, формирующих недетерминированные клубеньки (напри­мер, полное отсутствие клубеньков или образование клубеньков, лишенных бактерий) (Noel, 1992). Было показано, что добавление небольших количеств ЭПС может восстанавливать инфекци- онность ЭПС-мутантов (Djordjevic et al, 1987; Battisiti et al, 1992; Gonzalez et al, 1996). Это показывает, что ЭПС ризобий могут выполнять сигнальные функции. В то же время, ЭПС-мутан­ты могут нормально нодулировать растения, образующие детерминированные клубеньки, т.е. в этих клубеньках функции ЭПС несущественны или могут быть выполнены другими поверхностны­ми компонентами. Основываясь на симбиотических фенотипах, можно предположить, что ЛПС могут выполнять функции ЭПС при формировании детерминированных клубеньков. Для того, чтобы доказать это, необходимо выполнить два контрольных эксперимента. Во-первых, необходи­мо показать, что добавление ЛПС или его О-цепи компенсирует симбиотический дефект ЛПС- мутантов. Во-вторых, следует выяснить, может ли при образовании детерминированных клубень­ков ЭПС быть функционально заменен другим поверхностным полисахаридом, К-антигеном (см. раздел III), как это наблюдают в случае нодуляции люцерны некоторыми ЭПС-дефектными му­тантами S. meliloti (Petrovics et al, 1993; Reuhs et al, 1995).

При развитии инфекционных нитей в недетерминированных клубеньках ризобии окружают­ся растительной клеточной стенкой, которая формирует гиютный слой между бактериальной по­верхностью и цитоплазматической мембраной растительной клетки. Ионы, такие как бор или кальций, участвуют в развитии клубеньков (Munns, 1970; Sethi et al, 1981; Bolanos et al, 1994) и входят в состав растительной клеточной стенки. Показано, что пектиновые полисахариды расти­тельных клеточных стенок могут ковалентно связываться с бором (O'Neill et al, 1996). Важность кальция для поддержания уронидов и других отрицательно заряженных молекул обсуждается в гла­ве 22 и ряде работ (Brewin, 1991). Показано нарушение развития инфекционных нитей при недо­статке бора: увеличивается их размер и меняется форма, что обусловливает их разрыв и выход бактерий в поврежденную растительную клетку, а также сверх-продукцию материала матрикса, в котором находятся клетки ризобий, и нарушенный эндоцитоз (Bolanos et al, 1996). Это до оп­ределенной степени напоминает слабые защитные реакции, вызываемые Л ПС-мутантами в клу­беньках гороха (Perotto et al, 1994). Бор формирует эфирные связи с гидроксильными группами, которые особенно стабильны в некоторых диолах и полиолах (Loomis et al, 1992). Поэтому гидро- ксильные группы в коровом районе ЛПС у мутантов, а также в некоторых других компонентах, становятся доступными в результате определенных мутаций и могут приводить к освобождению бора из растительных клеточных стенок, что нарушает их стабильность. Возможно, что это может объяснить то, что различные классы ЛПС-мутантов ризобий (дефектные по О-цепи, имеющие редуцированный ЛПС или уменьшенное количество ЛПС-1) приводят к очень сходным изменени­ям у растений-хозяев. Другая возможность (которая не исключает первой) состоит в том, что освобождаемые поверхностные компоненты ЛПС-мутанта ризобий влияют на взаимодействие кле­точной стенки и цитоплазматической мембраны растительной клетки, что приводит к нарушению развития инфекционной нити (Mohnen et al, 1993; Penel et al, 1996).

Эндоцитоз бактерий. Эндоцитоз происходит при проникновении концов инфекционных нитей во вновь формируемые меристематические клетки. В этом месте конец инфекционной нити не имеет клеточной стенки, и ризобии окружаются "голой" растительной мембраной, образуя симби­осомы (Roth et al, 1989; Brewin, 1991). Однако остается непонятным, представляет ли этот про­цесс эндоцитоз или фагоцитоз, а также опосредован он рецепторами или интегринами (Verma et al, 1996). В любом случае тесный контакт растительной цитоплазматической мембраны с бакте­риальной клеточной поверхностью является важным, хотя участвующие в этом контакте бактери­альные компоненты до сих пор не выявлены. Во время эндоцитоза происходят существенные изме­нения бактериальной поверхности. В инфекционных нитях ризобии инкапсулированы поверхнос­тными полисахаридами (ЭПС, КПС), однако теряют свою капсулу при переходе в растительную клетку (Latchford et al, 1991; Roth et al, 1991; Brewin, 1991). Остается неясным механизм, вызы­вающий эти изменения (Kannenberg et al, 1994а).

Резко уменьшенное количество клеток, инфицированных ЛПС-мутантами ризобий гороха и вики, показывает, что ЛПС играет важную роль в эндоцитозе (Priefer, 1989; de Maagd et al, 1989b;

Perotto et al, 1994). Обсуждаются модели, согласно которым ЛПС играет роль в прикреплении ризобий к цитоплазматической мембране, как это наблюдается у некоторых патогенов животных (Jacques, 1996).

Развитие бактероидов. Внутри симбиосомы бактерии сначала размножаются, а затем пре­вращаются в плейоморфные зрелые азотфиксирующие бактероиды. В молодых симбиосомах рас­тущая растительная мембрана делится синхронно с бактериями и дифференцируется в функцио­нальную ПБМ. В симбиосомах гороха эти процессы происходят одновременно, вследствие чего каждый бактероид окружен индивидуальной ПБМ. В симбиосомах фасоли эта синхронность нару­шена, и в каждой симбиосоме находится несколько бактероидов (Brewin, 1991). В симбиосомах гороха на поверхности ПБМ отсутствует материал клеточной стенки. Тот факт, что синтез бакте­риальных ЭПС в симбиосоме подавлен (Latchford et al, 1991; Roth et al, 1991), предполагает, что контакт бактериальной клеточной стенки и ПБМ может быть очень тесным. Такой контакт дей­ствительно наблюдают в симбиосомах (Robertson et al, 1985; Roth et al, 1991), однако его функ­ции и обеспечивающие его молекулы еще не выявлены.

Судьба бактероидов, образованных ЛПС-мутантами ризобий, наиболее детально изучена для гороха (раздел 11.F.2.). Выявленные нарушения могут бьггь связаны с тем, что интактный ЛПС-1 необходим для нормального развития бактероидов (Kannenberg et al, 1992; Perotto et al, 1994). Привлекает внимание потеря синхронности деления бактерий и ПБМ на стадии внутриклеточного размножения (раздел II.F.2. и рис. 7). Возможно, что адгезия бактериальной мембраны и ПБМ важна для поддержания синхронности и что этот процесс нарушен в случае бактероидов, образован­ных ЛПС-мутантами. Некоторые данные о такой адгезии были получены при изучении изолирован­ных мембран из гомогенатов клубеньков (Bradley et al, 1996), но ее молекулярная основа неясна (Brewin, 1991). Поэтому неясно и то, прямо или косвенно участвуют ЛПС в процессе адгезии.

Некоторое понимание того, в чем заключается участие ЛПС в процессе адгезии, может быть получено при биохимическом изучении структурных адаптаций при развитии бактероидов. В клубеньках гороха бактероиды имеют уменьшенное количество ЛПС (van Brussel et al, 1977), в котором практически отсутствует ЛПС-2 (Sindhu et al, 1990), а ЛПС-1 имеет измененные разме­ры и антигенные свойства (Brewin et al, 1986; Sindhu et al, 1990; Kannenberg et al, 1992). Прямое химическое и иммунохимическое изучение показало, что бактероидные формы ЛПС-1 более гирофобны (Kannenberg et al, 1994b, 1996). Возможно, что молекулярная масса и гидро- фобность являются важными факторами в процессах адгезии, облегчая взаимодействие бактери­альной мембраны с ПБМ. Действительно, модификация эпитопов ЛПС происходит при размно­жении ризобий и их переходе в симбиосомы, что может быть связано с синтезом de novo более гидрофобных форм ЛПС (VandenBosch et al, 1989; Goosen-de Roo et al, 1991; Kannenberg et al, 1994c). При этом судьба ранее существовавших форм ЛПС остается неясной. Возможно, что бактериальные поверхностные структуры сбрасываются (Bal et al, 1980), однако эта точка зре­ния нуждается в дальнейших доказательствах. Постепенное замещение ранее существовавших ЛПС модифицированными формами, возникающими в результате синтеза de novo, также вызы­вает сомнения (Goosen-de Roo et al, 1991), так как смена эпитопов ЛПС происходит быстро. Этот факт наиболее совместим с модификацией ранее существовавших молекул, а не с их заме­ной на новые (Kannenberg et al, 1994с).

Выяснение функций ЛПС в дифференцировке бактерий затрудняется тем, что некоторые эпитопы экспрессируются на определенных стадиях развития симбиоза. Эти изменения показыва­ют, что в дополнение к общему повышению гидрофобности ЛПС важны и более специфичные структурные изменения. Например, в клубеньках гороха эпитопы ЛПС, узнаваемые монокло- нальным антителом МАС301, экспрессируются в тесной связи с нитрогеназной активностью (рис, 6). Однако, экспрессия специфичных для этой стадии эпитопов не связана напрямую с активнос­тью нитрогеназы, так как она наблюдается у ризобиальных мутантов по гену nifH, лишенных азотфиксации (Kannenberg et al, 1994с). Кроме того, экспрессия, специфичная для данной ста­дии, не может быть объяснена как результат изменения кислородного статуса клубенька, так что в данной модификации ЛПС могут участвовать дополнительные факторы, возможно связанные с растением (например, антоцианины).

Одной из общих функций ЛПС у грам-отрицательных бактерий является поддержание ста­бильности наружной мембраны (Vaara, 1992). Преждевременное старение бактероидов ЛПС-му­тантов в клубеньках гороха может быть объяснено нарушением стабильности мембраны (Perotto et al, 1994) или повышением чувствительности к стрессовым факторам, действующим внутри сим­биосомы. Эта гипотеза согласуется с результатами изучения мутанта гороха, имеющего нару­шенное развитие бактероидов (Borisov et al, 1992). В клубеньках этого мутанта, образуемых ризо- биями дикого типа, каждая симбиосома содержит несколько бактероидов, что характерно для клубеньков нормального гороха, образованных ЛПС-мутантом ризобий (Perotto et al, 1994). Хотя бактероиды в клубеньках мутанта гороха не могут фиксировать азот, они не подвергаются быстрой дегенерации, и в 4-недельных клубеньках не проявляют симптомов преждевременного старения, характерных для бактероидов, образованных ЛПС-мутантом и нормальными растениями гороха. Это наблюдение показывает, что нормальные клетки ризобий могут противостоять условиям в симбиосомах мутантного гороха, а преждевременное старение ЛПС-мутантных бактероидов связа­но с модификациями их клеточной стенки, обусловленными повышенной чувствительностью к физиологическим условиям и антимикробным факторам, действующим in planta.

Различия в модификации структуры ЛПС и изогенных штаммов R. leguminosarum (различаю­щихся только по "симбиотическим" плазмидам и проявляющих резкие различия структуры ЛПС, образуемого в клубеньках гороха и фасоли), предположительно, отражают различия физиологи­ческих условий в клубеньках разных растений. Возможно также, что растительные факторы уча­ствуют в определении выявленных различий. Известно, что при переходе ризобий в состояние бактероидов в клубеньках фасоли ЛПС становится более гидрофобным. Различия в экспрессии ЛПС в клубеньках фасоли и гороха дают новый материал для изучения тех различий между детерми­нированными и недетерминированными клубеньками, которые влияют на клеточную и тканевую инвазию ризобий, развитие бактероидов и симбиосом (Sutton et al, 1981; Kijne, 1990; Brewin, 1991; Roth et al, 1991). Кроме того, возможно, что многие структурные адаптации ЛПС, особен­но физиологически контролируемые, не обязательно ограничены определенными условиями клу­бенька (т.е. не обязательно являются строго клубенек-специфичными), но также могут быть важ­ны для адаптации к условиям почвы. Представление о более общей роли ЛПС в осуществлении адаптивных свойств ризобий позволит объяснить то, почему физиологические условия вызывают синхронные изменения экспрессии эпитопов ЛПС (Kannenberg et al, 1989, 1994с; Sindhu et al, 1990; Tao et al, 1992).

Старение клубеньков. Механизмы, определяющие старение бактероидов, изучены мало. Обычно считают, что условия внутри симбиосом являются для бактерий стрессовыми (Roth et al, 1991; Brewin, 1991). Симбиосомы могут представлять собой литические компартменты (Werner, 1992), в которых величины рН балансируются метаболической и азотфиксирующей активностями бактероидов (Kannenberg et al, 1989; Brewin, 1991). В соответствии с этой моделью, подкисление среды в симбиосоме, осуществляемое растением, может активировать литические ферменты, что в итоге приводит к старению бактероидов. Поскольку кислая среда индуцируют изменения эпи­топного состава ЛПС, возможно, что некоторые эпитопы, которые были подавлены в более моло­дых частях клубенька, начинают экспрессироваться в более старых частях (Kannenberg et al, 1994с). Однако неясно, связана ли экспрессия новых эпитопов со старением бактероидов.

II.G. СТРУКТУРНЫЕ АДАПТАЦИИ ЛПС И ДРУГИЕ МОДЕЛИ МЕЖКЛЕТОЧНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Изучение бактериальных патогенов животных и симбионтов растений позволило выявить об­щие черты структурной адаптации ЛПС. У патогенов животных ЛПС играют важную роль в инфици­ровании и в выживании внутри хозяина, то есть функционируют как факторы вирулентности (Raetz et al, 1993; Rietschel et al, 1994; Schletter et al, 1995; Proctor et al, 1995; Jacques, 1996; Goldberg et al, 1996; Moran et al, 1996). Например, у^штаммов, только что выделенных из инфицированной ткани животного, выявляются ЛПС с О-цепями, а варианты и мутанты, лиiинные Q-цс; лентны (Lynn et al, 1992rSclrnaItrnan et al, 1993; Whitfield et al, 1993; Whitfield, 1995; Foster et al.

 

1995). Это показывает, что для проявления патогенности необходима полная структура ЛПС (0- цепи, коровая часть, липид-А). Патогены животных подвержены лизису, вызываемому комплемен­том, а также фагоцитозу. Штаммы Salmonella enteritides, выделенные из селезенки цыплят, имеют ЛПС с высоким соотношением О-цепей к коровой части, что говорит о большом числе повторов 0- цепи в молекуле (Rahman et al, 1997). В целом, бактерии с многочисленными О-цепями наиболее устойчивы к лизису комплементом или к фагоцитозу. Возможно, что такие ЛПС защищают мембра­ну от атаки комплемента, снижая возможность его доступа к мембране (Valvano, 1992). Это показы­вает, что для клеточных взаимодействий важен определенный размер и концентрация ЛПС.

У Neisseria модификация (например, сиалитация) ЛПС может минимизировать защитные реакции, так как позволяет бактериям мимикрировать гликоконъюгаты хозяйских клеток (Van Futten, i993TPfeston et al, Г996), что говорит о важной роли специфичности в клеточных взаимодействи­ях. Однако, роль бактериальных ЛПС в патогенезе животных еще далека от полной изученности. В частности, мало понятны молекулярные механизмы и функции, определяющие действие ЛПС на бактериальную клетку и на межклеточные взаимодействия. Интересно, что ЛПС могут быть вовлечены в прикрепление к клеточным структурам и к компонентам внеклеточного матрикса (Jacques, 1996). Эти данные открывают новые пути для выяснения механизмов проникновения бактерий в клетку.

Проведенные работы показывают также чрезвычайную лабильность молекулярной структуры ЛПС. Они могут менять молекулярный размер, количество и состав в зависимости от специфичес­ких потребностей бактерии (выживание или межклеточные взаимодействия) в различных микроус­ловиях. Кроме того, активный генетический анализ патогенов животных, например, выявление генов, участвующих в присоединении О-цепей (Whitfield, 1995) позволит выяснить, имеются ли подобные гены у ризобий.

Изучение ЛПС у патогенов растений пока находится на описательной стадии (Denny, 1995). Возможно, что их первичными функциями являются обеспечение барьера для токсических факторов растения, а также выживание бактериальных клеток. Выявление ЛПС-мутантов Xanthomonas campestris с измененным коровым районом ЛПС согласуется с этим предположением (Dow et al, 1995). Реак­ция данных мутантов с различными хозяйскими и нехозяйскими растениями изменена, что выража­ется в снижении числа бактерий, выявляемых в течение первых 24 часов после инокуляции.

Имеются и данные в пользу более прямого участия ЛПС в инфицировании растений. Так, ЛПС X. campestris могут индуцировать экспрессию генов, связанных с защитой, у Brassica campestris (Newman et al, 1995), а инокуляция растений табака очищенными ЛПС некоторых бактерий может предотвращать реакцию гипер-чувствительности на несовместимые бактерии, а также подавлять симптомы совместимых взаимодействий (Mazzucchi, 1983). Возможно, что ЛПС участвуют также в индукции системной устойчивости против растительных патогенов (Sequeira, 1983; Leeman et al, 1995). Однако пока молекулярные механизмы этих процессов практически не изучены. Мало изве­стно также об участии структурных модификаций ЛПС в адаптации к стрессам, которым бактерии подвергаются, находясь внутри растений при развитии патогенного процесса.

Авторы: 1379 А Б В Г Д Е З И Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я

Книги: 1908 А Б В Г Д Е З И Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я